pcr實時熒光結(jié)果分析(實時熒光定量PCR具體實驗步驟是什么)

1.實時熒光定量PCR具體實驗步驟是什么

變性→退火→延伸三個基本反應步驟，答：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。

隨著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。我們實驗室用BIOG 染料法熒光定量PCR和BIOG探針法熒光定量PCR測得的擴增曲線起跳值一般在30左右，每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。

2.熒光定PCR中的注意事項

影響熒光PCR的因素很多，但從操作和技術(shù)上來講應該要注意一下幾點：

1. RNA的完整性

因為RNA一旦降解所定量的結(jié)果就不能正確反映樣品中mRNA的量，所得的結(jié)果也是錯誤的。所以在RNA提取過程中要嚴格遵守操作規(guī)范，避免RNA酶的污染。

2. RNA樣品中的基因組DNA污染

提取的RNA樣品中不可避免地混有少量的基因組DNA。基因組DNA對試驗有兩個影響：一是影響對RNA的精確定量；二是影響PCR擴增的特異性。

3. PCR反應體系的優(yōu)化

PCR擴增過程必須保證擴增產(chǎn)物只有特異的目標產(chǎn)物，為此，首先要保證PCR反應體系達到最優(yōu)。目前許多公司都有用于實時定量PCR反應的試劑盒，可以方便PCR反應的操作。

4. 反轉(zhuǎn)錄

反轉(zhuǎn)錄所得cDNA的量必須精確地等于相應的mRNA的量，反轉(zhuǎn)錄對于實時定量PCR來說是非常關鍵的一步。目前常用的反轉(zhuǎn)錄酶有2種：AMV-RT和MMLV-R。反轉(zhuǎn)錄常用的引物有隨機引物、Oligo-dT和特異引物。相比之下Oligo-dT和特異性引物更適合實時定量PCR。

5.利用實時定量PCR研究基因表達時，一般用相對定量的方法相對定量必須用到內(nèi)標基因?？煽康膬?nèi)標基因應是在不同細胞類型、不同試驗條件下都穩(wěn)定表達的持家基因。常用的內(nèi)標基因有β-tublin、actin、

GAPDH、18sRNA、efla和Cyclophilin等。盡管在大多數(shù)情況下這些持家基因的表達非常穩(wěn)定，但是

最近有報道認為這些持家基因的表達在某些情況下會發(fā)生變化。也就是說并不是任何內(nèi)標基因都適合

任何試驗。在選擇內(nèi)標基因時，應仔細考慮各種因素，選擇合適的內(nèi)標基因或內(nèi)標基因組合。